CANCER RESEARCH 61 - 4675-4678, June 15, 2001
Advances in Brief
Analysis of Circulating Tumor DNA in Plasma at Diagnosis and during Follow-Up of Lung Cancer Patients
Gabriella Sozzi, Davide Conte, Luigi Mariani, Salvatore Lo Vullo, Luca Roz, Claudia Lombardo, Marco A. Pierotti, and Luca Tavecchio

Abstract
In questo studio abbiamo quantificato i livelli di DNA circolante nel plasma di un gruppo di 84 pazienti con cancro polmonare e di un gruppo di 43 individui sani allo scopo di capire se I livelli di DNA circolante possano discriminare pazienti con tumore da individui sani. Inoltre 38 pazienti sono stati monitorati dopo la rimozione del tumore, durante il follow-up, allo scopo di chiarire se variazioni nei livelli di DNA circolante nel plasma e la presenza di specifiche alterazioni genetiche erano associate allo stato clinico del paziente. E' stato utilizzato un test di laboratorio di tipo colorimetrico, di facile e veloce esecuzione (DNA dip-sticks) e, per conferma, un test piu' raffinato di quantificazione mediante PCR ( real time Q-PCR). Infine per dimostrare la natura tumorale di questo DNA abbiamo analizzato la presenza di alterazioni dei microsatelliti del gene FHIT, un'alterazione molto frequente nei tumori polmonari. I risultati di questo studio hanno indicato che nei pazienti valori di DNA circolante nel plasma sono almeno 10 volte superiori a quelli riscontrati negli individui sani.La sensibilita' e la specificita' del test si sono rivelate alte. Nei 38 pazienti seguiti durante il follow-up dopo la rimozione chirurgica del tumore, abbiamo osservato che i livelli di DNA scendevano significativamente fino a raggiungere un valore simile a quello osservato negli individui che si mantenevano sani. Al contrario un aumento fino a 20 volte si e' osservato nei prelievi di plasma di alcuni pazienti che al controllo clinico sono risultati avere una ripresa o localizzazioni metastatiche del tumore. In questi stessi pazienti si sono anche riscontate nel DNA circolante nel plasma le stesse alterazioni genetiche (FHIT) che erano inizialmente presenti nel tumore confermando quindi la presenza di DNA tumorale nel plasma. Nel loro insieme questi risultati suggeriscono che la quantificazione e la caratterizzazione molecolare del DNA circolante nel plasma possono rappresentare degli utili strumenti diagnostici per discriminare pazienti con tumore verso individui sani e possono esssere utilizzati come metodo non invasivo per identificare precocemente ripresa di malattia durante il follow up.

Clinical Cancer Research Vol. 5
2689-2692, October 1999
Detection of Microsatellite Alterations in Plasma DNA of Non-Small Cell Lung Cancer Patients: A Prospect for Early Diagnosis
Gabriella Sozzi, Katia Musso, Cathy Ratcliffe, Peter Goldstraw, Marco A. Pierotti, and Ugo Pastorino

Abstract
Questo lavoro e' stato uno dei primi a dimostrare la presenza di DNA circolante nel plasma di individui con cancro polmonare e a prospettare la possibilita' di utilizzarlo per analisi molecolari di biomarcatori utili per la diagnosi precoce di cancro polmonare.
Abbiamo effettuato uno studio riguardante l'identificazione di alterazioni di microsatelliti nel DNA circolante presente nel plasma di pazienti con tumore polmonare NSCLC. Abbiamo analizzato alterazioni a carico di diversi loci incluso FHIT/FRA3B in 87 pazienti e 14 controlli. E' stata riscontrata la presenza di alterazioni genetiche nel plasma nel 60% dei pazienti che presentavano la corrispondente alterazione nel DNA tumorale. Di particolare interesse l'osservazione che alterazioni genetiche nel plasma erano gia' presenti nel 43% dei pazienti con tumore in Stadio I e nel 45% dei pazienti con tumore inferiore ai 2 cm di diametro. Queste osservazioni possono avere importanti risvolti per l'applicazione clinica: infatti considerata l'elevata quantita' di DNA circolante anche nei pazienti in Stadio I e II, quindi con malattia curabile, l'analisi genetica del plasma potrebbe essere impiegata in programmi di diagnosi precoce. L'uso combinato di altri marcatori genetici frequentemente alterati nel tumore potrebbe inoltre aumentare la sensibililita' del test genetico.

Cancer Research - Vol. 8, 3782-3787, December 2002
p16INK4A Hypermethylation Detected by Fluorescent Methylationspecific PCR in Plasmas from Non-Small Cell Lung Cancer
Alessandra Bearzatto, Davide Conte, Milo Frattini, Nadia Zaffaroni, Francesca Andriani, Debora Balestra, Luca Tavecchio, Maria Grazia Daidone and Gabriella Sozzi

Abstract
In questo studio abbiamo messo a punto un saggio MSP (methylation specific PCR) con una rilevazione in fluorescenza (F-MSP) allo scopo di migliorare la sensibilita' del test per identificare la presenza di metilazione genica in fluidi biologici. Sono stati esaminati campioni, tissutali e plasmatici, derivati da 35 pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule gia' studiati per la quantificazione del DNA circolante (Sozzi G. Can. Res. 2001) Usando F-MSP la rilevazione dei campioni di plasma metilati e' aumentata di 6 volte (da 2 a 12 casi) rispetto a MSP standard, e la metilazione di p16INK4A si e' dimostrata rilevabile nel 54% dei ventidue campioni di plasma ottenuti da pazienti con tumori metilati. L'associazione dello stato di metilazione di p16INK4A nei tumori al polmone e nei plasmi corrispondenti e' statisticamente significativa (p=0.004). Nei campioni di plasma dei 32 pazienti i cui tumori esibiscono almeno un marcatore alterato, l'ipermetilazione di p16INK4A e le alterazioni dei microsatelliti sono presenti singolarmente in 12 e 10 casi rispettivamente, mentre in associazione possono essere rinvenute in diciotto casi (56%). L'ipermetilazione di p16INK4A oppure l'instabilita' dei microsatelliti ritrovati nel plasma corrispondono in diciotto casi allo stesso profilo molecolare alterato esibito da ventinove tumori (62%). Inoltre in ventidue dei trentacinque plasmi (67%) sono presenti livelli di DNA circolante piu' elevati di 125 ng/ml, corrispondenti al 100% di specificita' nel discriminare i tumori dai donatori sani, come calcolato in base alla curva ROC utilizzata per valutare simultaneamente sensibilita' e specificita' del test (Sozzi 2001). Una tale percentuale di identificazione sale all'80% se viene considerata anche la metilazione di p16INK4A.

Int. J. Cancer: 108
91-96 (2004)
Detecting lung cancer in plasma with the use of multiple genetic markers
Francesca Andriani, Davide Conte, Tiziana Mastrangelo, Mariaelena Leon, Cathy Ratcliffe, Luca Roz, Giuseppe Pelosi,Peter Goldstraw, Gabriella Sozzi and Ugo Pastorino

Abstract
In questo studio abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla possibilita' di combinare tre marcatori molecolari che rappresentano le principali alterazioni nei tumori polmonari (p53, FHIT, alterazioni di microsatelliti sul cromosoma 3p) per identificare precocemente i tumori polmonari. I tre marcatori sono stati studiati con metodiche molto sensibili (PCR fluorescente, plaque hybridization assay) per identificare alterazioni molecolari sul DNA libero circolante nel plasma di 76 pazienti con tumore polmonare (Stadio I-III). Le mutazioni di p53 sono state riscontrate nel 41% dei tumori polmonari e nel 73% dei corrispondenti plasmi e le alterazioni di FHIT e del 3p nel 62% dei tumori e nel 47.5% dei plasmi. Almeno un marcatore era alterato nel plasma di 52% di tutti i pazienti e nel 61% dei pazienti con tumore in stadio iniziale (Stadio I). Inoltre, nell'ambito dei pazienti con alterazioni molecolari nel tumore, i marcatori genetici sul plasma hanno identificato il 64% dei pazienti in tutti gli stadi e il 68% dei pazienti in Stadio I. Questi risultati suggeriscono che l'uso di un pannello di appropriati marcatori molecolari aumenta la sensibilita' nell'identificare alterazioni tumore-specifiche nel DNA plasmatico e supportano l'utilizzo di test molecolari sul plasma come strategia non invasiva per la diagnosi precoce di cancro polmonare.

Int. J. Cancer: 118
1248-1253 (2006)
Methylation profile in tumor and sputum samples of lung cancer patients detected by spiral computed tomography: A nested case-control study
Rosalia Cirincione, Carla Lintas, Davide Conte, Luigi Mariani, Luca Roz, Antonio Maurizio Vignola, Ugo Pastorino and Gabriella Sozzi

Abstract
In questo lavoro abbiamo condotto uno studio di valutazione del profilo di metilazione di un pannello di tre geni (RARß2, p16INK4A,RASSF1A) in 29 pazienti con tumore polmonare identificato con TAC spirale e in un gruppo di controllo di 112 forti fumatori non affetti da neoplasia. La valutazione della metilazione genica su DNA estratto da tessuto tumorale ed espettorato, e' avvenuta mediante nested-PCR metilazione specifica (MSP test), che permette una migliore discriminazione del DNA efficientemente convertito tramite sodio bisolfito e una piu' specifica amplificazione del DNA metilato rispetto al DNA parzialmente convertito. L'uso di due set di primers che distinguono il DNA convertito e che amplificano differenzialmente i prodotti metilati e non metilati sono alla base di questa metodica. Le condizioni sperimentali sono state definite cercando di avere un giusto rapporto fra specificita' e sensibilita', risultata essere di 1/1000.
L'applicazione di questo test ai campioni dello studio ha caratterizzato la metilazione di p16INK4A e di RARß2 come marcatore di esposizione al fumo, piuttosto che tumore-specifico, poiche' la percentuale di ipermetilazione trovata nell'espettorato e nel tumore di pazienti identificati con TAC spirale (prevalentemente adenocarcinomi) e' molto simile a quella rilevata nei forti fumatori di controllo. Invece per quanto riguarda il gene RASSF1A abbiamo visto metilazione nel 51.7% dei casi di tumore identificati con TAC spirale, nel 5.6% dei rispettivi espettorati e in un solo caso di controllo (0.9%).
La metilazione di RASSF1A potrebbe essere quindi considerata un vero marcatore tumore-specifico, soprattutto se si confrontano questi dati con quelli relativi a 15 pazienti con diagnosi di tumore in fase sintomatica (tumori di tipo squamoso e non identificati tramite TAC spirale). In questi pazienti il promotore del gene RASSF1A e' risultato metilato nel 52.3% dei tumori e similmente nel 62% dei rispettivi campioni di espettorato.
La discordanza sulla frequenza della metilazione di RASSF1A nell'espettorato dei pazienti sintomatici e dei pazienti identificati nel programma di screening e' imputabile alle diverse caratteristiche clinico-patologiche dei tumori dei pazienti considerati nei diversi studi, poiche' la localizzazione dei tumori squamosi e' di solito piu' prossimale ai bronchi rispetto a quella degli adenocarcinomi che e' piu' periferica e inoltre l'esfogliazione cellulare dei tumori di tipo squamoso e' maggiore rispetto a quella degli adenocarcinomi.
In questo contesto di screening stiamo valutando l'applicazione della Real-time PCR quantitativa a studi di metilazione. L'uso di questo test molecolare infatti fornirebbe una valutazione quantitativa oltre che qualitativa dello stato di metilazione dei geni target. Oltre ad essere caratterizzato da alta sensibilita', specificita' e riproducibilita' risulta essere compatibile con la presenza di basse quantita' di DNA templato e quindi con il campionamento di fluidi biologici quali espettorato/lavaggio bronchiale e plasma.

JCO Nov 1 2003:
3902-3908
Quantification of Free Circulating DNA As a Diagnostic Marker in Lung Cancer
Gabriella Sozzi, Davide Conte, MariaElena Leon, Rosalia Cirincione, Luca Roz, Cathy Ratcliffe, Elena Roz, Nicola Cirenei, Massimo Bellomi, Giuseppe Pelosi, Marco A. Pierotti, and Ugo Pastorino

Abstract
L'idea di andare a ricercare il DNA libero da cellule (nudo) circolante nel plasma o nel siero venne qualche anno fa ad un fisiologo svizzero che, avendolo riscontrato nella linfa delle piante, volle scoprire se fosse presente anche nel plasma di pazienti con tumore in stadio avanzato. Con saggi radioimmunologici ne dimostro' la presenza. In tempi successivi dal nostro e da altri laboratori Americani sono stati pubblicati studi che indicavano l'origine tumorale del DNA circolante nel plasma dimostrando la presenza di alterazioni genetiche tipiche del DNA tumorale nel DNA plasmatico in pazienti con vari tipi di neoplasia quali i tumori della testa e del collo, polmone, colon, fegato, pancreas.
Recentemente nel nostro laboratorio ci siamo indirizzati alla messa a punto di test sensibili di quantificazione del DNA libero circolante nel plasma allo scopo di chiarire se una accurata quantificazione dei livelli totali di DNA plasmatico possa rappresentare un semplice, sensibile ed accurato strumento diagnostico per discriminare pazienti con tumore polmonare verso individui sani.
Il lavoro apparso nel fascicolo del 1 Novembre 2003 su Journal of Clinical Oncology (sotto riportato) descrive la messa a punto di un test preciso e sensibile di quantificazione del DNA libero circolante nel plasma plasmatico basato sull'uso della Real-Time PCR Quantitativa. Questa metodica permette un'accurata amplificazione quantitativa del DNA mediante monitoraggio ottico continuo di una reazione di PCR fluorogenica e arriva a quantificare fino a 1 genoma-equivalente, cioe' 6pg di DNA genomico, il contenuto di DNA di una singola cellula. Abbiamo utilizzato come gene indicatore il gene della trascriptasi inversa della telomerasi umana, hTERT, un gene a singola copia localizzato sul cromosoma 5p15.33. Abbiamo quindi determinato la sensibilita' e la specificita' di questo test sul plasma in un largo studio caso-controllo di 100 pazienti con tumore polmonare non a piccole cellule (NSCLC) e 100 controlli appaiati per eta', sesso e abitudine al fumo (forti fumatori) raccolti presso l' Istituto Europeo di Oncologia di Milano. Inoltre abbiamo incluso un gruppo di 30 individui non fumatori appaiati per eta'. Abbiamo valutato l'efficienza diagnostica del test sul plasma mediante costruzione della receiver-operating characteristic curve (ROC). E' stata inoltre usata l'analisi di regressione logistica condizionale per stabilire il coefficiente di rischio (odd ratios) di sviluppare cancro polmonare negli individui che presentano elevati livelli di DNA plasmatico.
La concentrazione mediana del DNA circolante nel plasma dei pazienti e' risultata superiore di 8 volte a quella riscontrata nei controlli. L'area sotto la curva ROC e' risultata di 0.94 ( 95% CI = 0.907-0.973) suggerendo un ottimo potere discriminante del test molecolare (il massimo potere discriminante equivale a 1). E' stata stabilita per diversi valori di DNA circolante la sensibilita', la specificita', il valore predittivo positivo (PPV) e negativo (NPV). La concentrazione del DNA nel plasma e' risultata un forte fattore di rischio per cancro polmonare in quanto le concentrazioni nel tertile piu' alto (> 20 ng/ml) erano associate ad un rischio 85 volte maggiore rispetto a al tertile piu' basso (< 4 ng/ml). Il valore di DNA plasmatico nel gruppo degli individui non fumatori e' risultato inferiore ad 1 ng/ml indicando quindi quantita' molto basse di DNA in circolo negli individui non esposti al fumo.
In 35 dei pazienti con tumore polmonare valutati per la quantita' di DNA plasmatico prima della chirurgia, abbiamo potuto studiare uno o piu' prelievi di plasma successivi per monitorare le variazioni nella concentrazione del DNA plasmatico durante il follow-up clinico (3-15 mesi dopo la chirurgia, tempo mediano 8 mesi). La concentrazione mediana dei successivi campioni di plasma ha mostrato una significativa diminuzione rispetto ai valori basali. In particolare l' analisi dei livelli di DNA plasmatico in relazione allo stato clinico della malattia ha evidenziato una concentrazione di DNA significativamente piu' bassa in 30 individui liberi da malattia rispetto a 5 in ripresa di malattia.
In conclusione, questo studio ci ha permesso di dimostrare che la quantificazione del DNA circolante nel plasma tramite una raffinata metodica molecolare puo' rappresentare un utile strumento diagnostico per discriminare pazienti con tumore rispetto a individui sani e, potenzialmente, per identificare gli individui ad aumentato rischio di cancro quali i forti fumatori nelle fasi molto iniziali della malattia. Inoltre questo test puo' esssere utilizzato come metodo non invasivo per identificare precocemente ripresa e metastasi tumorali durante il follow up dei pazienti.
Il lavoro e' stato accompaganto da un Editoriale della rivista stessa (sotto riportato) che ne ha illustrato i contenuti ed evidenziato le importanti possibili applicazioni diagnostiche future.

J Natl Cancer Inst 2005;
97:1848 - 50
Effects of Prolonged Storage of Whole Plasma or Isolated Plasma DNA on the Results of Circulating DNA Quantification Assays
Gabriella Sozzi, Luca Roz, Davide Conte, Luigi Mariani, Francesca Andriani, Paolo Verderio, Ugo Pastorino

Abstract
Lo studio riguarda l'utilizzo di biomarcatori per la diagnosi precoce di cancro polmonare. I ricercatori avevano in precedenza dimostrato che la quantita' di DNA libero circolante nel plasma, misurata mediante una tecnica accurata di real-time PCR, e' molto piu' elevata nei pazienti con cancro polmonare rispetto a individui sani e ne suggerivano un possibile utilizzo per la diagnosi precoce di cancro polmonare.
Nel presente studio i ricercatori hanno rivalutato gli stessi campioni biologici dopo crio-conservazione per un arco di tempo di circa quattro anni e riportano che, a fianco di un intatto potere discriminante del test diagnostico tra individui malati e sani, si riscontra pero' una significativa diminuzione, intorno al 30% per anno, dei livelli di DNA plasmatico sia nei pazienti che nei controlli. Tale decadimento, che si verifica sia nel DNA plasmatico gia' isolato che nei campioni di plasma congelati prima dell'isolamento del DNA, e' quindi un fattore critico che deve essere accuratamente considerato e valutato per le analisi retrospettiche di campioni biologici conservati e quando si disegnano studi che prevedano l'uso di biomarcatori nel plasma nell'ambito di grandi trials clinici di diagnosi precoce e di monitoraggio della malattia.

Letter to the Editor
Lung Cancer 66 (2009) 268-273
Plasma DNA levels in spiral CT-detected and clinically detected lung cancer patients: A validation analysis
Luca Roz, Carla Verri, Davide Conte, Rosalba Miceli, Luigi Mariani, Elisa Calabro', Francesca Andriani, Ugo Pastorino, Gabriella Sozzi

Abstract
Allo scopo di confermare i precedenti risultati relativi alla quantificazione dei livelli di DNA plasmatico nei pazienti con tumore polmonare diagnosticato clinicamente (Sozzi G., JCO 2003) o identificato mediante TAC spirale (Sozzi G., AJRCCM 2009), abbiamo esteso la nostra analisi dei livelli di DNA plasmatico circolante ad una serie di tumori polmonari identificati con TAC spirale nell'ambito di un trial randomizzato multicentrico Italiano per la diagnosi precoce di cancro polmonare (MILD), iniziato nel 2005 all'INT.
Alla fine del terzo anno e' stato identificato tumore polmonare in 31 soggetti, 20 dei quali (13 casi prevalenti, 7 casi incidenti) sono stati sottoposti a resezione chirurgica. 14/20 tumori sono risultati adenocarcinomi e 15/20 erano in Stadio IA-B.
Come gruppo di controllo sono stati analizzati 20 pazienti con tumore polmonare diagnosticato clinicamente con distribuzione simile di istotipo (11/20 adenocarcinoma) e stadio (10/20 Stadio IA-B). Inoltre 89 fumatori liberi da malattia reclutati nello studio MILD e appaiati per sesso, eta', fumo sono stati inclusi nel disegno sperimentale. Tutti i campioni sono stati appaiati per tempo di raccolta, separazione del plasma e tempo di conservazione. L'estrazione del DNA di tutti i campioni di plasma (casi e controlli) e la quantificazione del DNA plasmatico ( real-time PCR) sono state effettuate seguendo le procedure validate negli studi precedenti.
I livelli mediani di DNA plasmatico al tempo della chirurgia sono risulati pari a 4.2 ng/ml nei 20 pazienti identificati nello studio MILD (5.3 ng/ml nei casi incidenti e 3.8 ng/ml nei casi prevalenti); 16.2 ng/ml nei pazienti con tumore polmonare diagnosticato clinicamente (p =0.0003)e 4.2 ng/ml nei fumatori liberi da malattia del trial MILD (p=0.6).
Questi risultati validano quelli ottenuti nei nostri studi precedenti e indicano che il rilascio di DNA nel plasma e' un evento relativamente tardivo nella storia naturale del cancro polmonare ed e' probabilmente correlato all'instaurarsi di un certo livello di interazione tra il tumore ed il microambiente circostante. Globalmente questi risultati indicano che i livelli di DNA plasmatico circolante potrebbero costituire un indicatore del differente comportamento metastatico e migliorare quindi la gestione clinica dei tumori polmonari identificati con TAC spirale.